一、生物指示物法（最核心、最精準(zhǔn)的驗(yàn)證方法）

生物指示劑（Biological Indicator, BI）是一種對規(guī)定滅菌過程有特定的抗力，含有活微生物的測試系統(tǒng)，可用于滅菌設(shè)備的性能確認(rèn)、特定物品的滅菌工藝研發(fā)、建立、驗(yàn)證，生產(chǎn)過程滅菌效果的監(jiān)控，也可用于隔離系統(tǒng)和無菌潔凈室除菌效果的驗(yàn)證評估等。

常用的生物指示性菌株有：

1.嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）芽孢，ATCC7953

適用于濕熱滅菌（高壓蒸汽滅菌，121℃/134℃），該菌株芽孢對濕熱滅菌的抗性最強(qiáng)，若殺菌后芽孢全部死亡，證明工藝有效。常見商品化產(chǎn)品如下圖

使用方法：

（1）將BI置于滅菌器最難滅菌位置；

（2）按照日常滅菌工藝滅菌后取出，放入復(fù)蘇培養(yǎng)基（如TSB 培養(yǎng)基）；

（3）37-60℃培養(yǎng) 48-72h，觀察是否渾濁，如果渾濁代表有菌生長等于滅菌失敗。

2.枯草芽孢桿菌黑色變種（Bacillus subtilis var. niger）芽孢, ATCC9372

適用于干熱滅菌、紫外線滅菌、環(huán)氧乙烷滅菌方式，對干熱、輻射等具有強(qiáng)抗性， 

使用方法：
（1）該芽孢菌片適用于環(huán)氧乙烷（包括微波、干熱）滅菌檢測。
（2）使用時將裝有菌片的小紙袋放在被滅菌的物品中心部位（每鍋放置菌片數(shù)按衛(wèi)生部規(guī)定）。
（3）滅菌后，在無菌操作下取出小紙袋中的菌片，投放到培養(yǎng)液中。同時將2片未經(jīng)滅菌的菌片分別投入2管培養(yǎng)液中作對照。
（4）37℃培養(yǎng)7天觀察結(jié)果，對照管呈渾濁；若滅菌后菌片培養(yǎng)液呈清亮、無渾濁，為陰性（－），表示滅菌徹底；如培養(yǎng)液呈渾濁，為陽性（+），表示滅菌不徹底。
（5）當(dāng)出現(xiàn)陽性結(jié)果后，為確定是否為滅菌后接種操作過程中污染其他菌種時，可在無菌室內(nèi)取0.2ml懸液接種營養(yǎng)瓊脂平板用無菌L棒涂抹均勻，置37℃培養(yǎng)24h后，涂片顯微鏡下觀察菌落形態(tài)或做進(jìn)一步試驗(yàn)。

同上述培養(yǎng)法，部分可采用酶底物法快速檢測（1-2h 出結(jié)果）。

3.銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）

適用于消毒劑殺菌效果驗(yàn)證，代表革蘭氏陰性菌，用于評價消毒劑對環(huán)境/ 器械的殺菌能力活菌計數(shù)法：計算殺菌前后的菌落數(shù)，計算殺菌率。

步片式使用方法如下：

（1）消毒前，按照布點(diǎn)要求，將菌片放置于消毒評價現(xiàn)場；

（2）消毒達(dá)到作用時間后，用無菌鑷子將菌片移入裝有5.0mL相應(yīng)中和劑試管中，在手心振打80 次或用混勻器混勻，中和10min。

（3）設(shè)立陽性對照組。低溫現(xiàn)場消毒時，陽性對照組與試驗(yàn)組一起放入相應(yīng)低溫環(huán)境，達(dá)到相同低溫后，放入稀釋液中。

（4）將采樣管在混勻器上振蕩20s 或在手心振打80 次，吸取1.0mL 待檢樣品接種于無菌平皿，每一個樣本平行接種2個平皿，并按標(biāo)準(zhǔn)要求使用相應(yīng)的培養(yǎng)基接種培養(yǎng)。

（5）計數(shù)菌落數(shù)，計算殺滅率。具體按照《GB/T 38502-2020消毒劑實(shí)驗(yàn)室殺菌效果檢驗(yàn)方法》使用說明進(jìn)行環(huán)境消毒現(xiàn)場評價。

4.金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

適用于消毒劑殺菌效果驗(yàn)證，代表革蘭氏陽性菌，模擬皮膚/黏膜常見污染菌

常用活菌計數(shù)法、抑菌圈法

應(yīng)用場景：高壓蒸汽滅菌器的日常驗(yàn)證、新殺菌工藝的確認(rèn)、消毒劑消毒效果評價。

二、微生物學(xué)驗(yàn)證法（直接檢測殺菌后微生物殘留）

通過直接培養(yǎng)殺菌后的樣品，統(tǒng)計存活微生物數(shù)量，判斷殺菌是否達(dá)標(biāo)，適用于培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)樣品、環(huán)境表面的殺菌驗(yàn)證。

活菌計數(shù)法

步驟：

① 取殺菌后的樣品（如滅菌后的培養(yǎng)基、器械洗脫液、環(huán)境擦拭液）；

② 梯度稀釋后，涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；

③ 37℃培養(yǎng)24-48h，計數(shù)菌落數(shù)（CFU）；

④ 判定標(biāo)準(zhǔn)：無菌樣品（如無菌培養(yǎng)基）菌落數(shù)應(yīng)為 0 CFU；環(huán)境表面需符合實(shí)驗(yàn)室潔凈度標(biāo)準(zhǔn)（如萬級實(shí)驗(yàn)室＜10CFU/皿）。

適用場景：無菌培養(yǎng)基滅菌驗(yàn)證、實(shí)驗(yàn)室操作臺消毒效果檢測、實(shí)驗(yàn)廢液殺菌后排放驗(yàn)證。

無菌檢查法

步驟：

① 將殺菌后的樣品（如無菌器械、凍干試劑）接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（需氧+厭氧）和改良馬丁培養(yǎng)基（真菌）；

② 分別在30-35℃（細(xì)菌）和20-25℃（真菌）培養(yǎng) 14 天；

③ 若培養(yǎng)基澄清，判定為無菌；若渾濁，需進(jìn)一步確認(rèn)是否為污染菌。

適用場景：無菌實(shí)驗(yàn)耗材（如移液管、離心管）、注射用試劑的滅菌驗(yàn)證，符合《中國藥典》無菌檢查規(guī)范。

三、物理化學(xué)指示劑法（快速、便捷的輔助驗(yàn)證方法）

通過監(jiān)測殺菌過程中的關(guān)鍵物理參數(shù)（溫度、壓力、時間）或化學(xué)變化，間接判斷殺菌效果，操作簡單，適合日常巡檢，但不能替代生物指示劑法。

1. 物理指示劑法

溫度壓力記錄儀：用于高壓蒸汽滅菌器、干熱滅菌箱，實(shí)時記錄滅菌過程中的溫度、壓力曲線，確認(rèn)是否達(dá)到設(shè)定參數(shù)（如121℃、0.1MPa、15min）。

留點(diǎn)溫度計：放入滅菌器內(nèi)，滅菌后讀取最高溫度值，判斷是否達(dá)到目標(biāo)溫度（如干熱滅菌需160℃維持2h，溫度計讀數(shù)需≥160℃）。

紫外線強(qiáng)度計：用于紫外線殺菌燈的效果驗(yàn)證，測定紫外線輻照強(qiáng)度，要求在燈管下方1m 處強(qiáng)度≥70μW/cm²（低于此值需更換燈管）。

2. 化學(xué)指示劑法

化學(xué)指示劑通過顏色變化反映殺菌條件是否達(dá)標(biāo)，分為類別指示劑和過程指示劑。

指示劑類型常見產(chǎn)品變色原理適用場景

（1）壓力蒸汽滅菌化學(xué)指示卡/膠帶：

代表產(chǎn)品：變色膠帶、指示卡

變色原理：遇高溫高壓蒸汽后，指示劑中的化學(xué)物質(zhì)發(fā)生變色反應(yīng)（如黃色→黑色）。

適用場景：日常滅菌包外標(biāo)識，快速判斷是否經(jīng)過滅菌處理。

（2）干熱滅菌化學(xué)指示劑

代表產(chǎn)品：干熱指示條

變色原理：160℃以上高溫下，指示劑涂層變色。

適用場景：干熱滅菌器的日常巡檢。

（3）環(huán)氧乙烷滅菌指示劑

代表產(chǎn)品：EO 指示卡

變色原理：與環(huán)氧乙烷氣體反應(yīng)后變色

適用場景：環(huán)氧乙烷滅菌的醫(yī)療器械驗(yàn)證

重點(diǎn)提示：只證明經(jīng)過滅菌處理，不代表滅菌效果

四、驗(yàn)證注意事項(xiàng)

驗(yàn)證位置：殺菌時需將指示劑/ BI 放置在最難滅菌的位置（如滅菌器底部、大型器械內(nèi)部），確保驗(yàn)證結(jié)果具有代表性。

陰性對照：每次驗(yàn)證需設(shè)置陰性對照（未殺菌的BI/樣品），確認(rèn)培養(yǎng)體系無污染。

定期驗(yàn)證：高壓蒸汽滅菌器需每周用BI驗(yàn)證一次，每日用化學(xué)指示卡巡檢；紫外線燈需每季度檢測一次強(qiáng)度。