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霉菌培養(yǎng)空白總長菌怎么辦？

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期：2025-11-28
核心提示：摘要霉菌培養(yǎng)箱空白長菌（即無樣品的空白對照長出霉菌 / 雜菌），核心原因是培養(yǎng)箱內(nèi)存在污染殘留、無菌操作不當、空白載體本身帶
摘要
霉菌培養(yǎng)箱空白長菌（即無樣品的空白對照長出霉菌 / 雜菌），核心原因是培養(yǎng)箱內(nèi)存在污染殘留、無菌操作不當、空白載體本身帶菌或環(huán)境空氣二次污染。以下是按 “排查優(yōu)先級” 整理的原因分析、解決方案及預(yù)防措施，兼顧實驗室實操性和可執(zhí)行性：
一、先做 3 個快速排查（1 天內(nèi)定位核心問題）

1. 空白載體本身是否帶菌？（最易忽略）
排查對象：
空白培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基、無菌水、封口膜等耗材。
驗證方法：
直接將未開封的空白培養(yǎng)皿（或剛配制的無菌培養(yǎng)基）不放入培養(yǎng)箱，在超凈臺內(nèi)密封培養(yǎng)（同條件溫濕度），若仍長菌→耗材本身污染；
若僅放入培養(yǎng)箱的空白長菌，超凈臺內(nèi)培養(yǎng)的空白無菌→污染來自培養(yǎng)箱或操作過程。
解決方案：
  • 更換合格耗材（選擇有滅菌合格證的一次性培養(yǎng)皿，自制培養(yǎng)基需 121℃高壓滅菌 20min，冷卻后立即使用）；
  • 培養(yǎng)基滅菌后避免長時間暴露在空氣中，分裝時超凈臺風速≥0.3m/s，紫外線消毒 30min 后再操作。
2. 培養(yǎng)箱內(nèi)是否有可見污染殘留？（最常見原因）
排查重點：
  • 內(nèi)膽角落、擱板縫隙、門封條褶皺處是否有霉斑、培養(yǎng)基殘留、水漬；
  • 濕度發(fā)生器（加濕器）水箱是否有渾濁、異味（滋生霉菌 / 細菌）；
  • 通風口、過濾器是否堵塞或發(fā)霉（部分培養(yǎng)箱有 HEPA 過濾器，需檢查是否失效）。
驗證方法：用無菌棉簽擦拭內(nèi)膽、門封條、擱板，涂抹在空白培養(yǎng)基上培養(yǎng)，若長出與空白相同的菌→培養(yǎng)箱內(nèi)殘留污染。
3. 操作過程是否引入污染？（人為因素）
排查場景：
  • 放入 / 取出空白時，培養(yǎng)箱門打開時間過長（超過 30 秒），環(huán)境空氣進入；
  • 操作人員手、手套接觸空白培養(yǎng)皿邊緣或開口；
  • 超凈臺未消毒（或紫外線燈失效），分裝空白時引入雜菌。
驗證方法：同一批空白，分兩組操作 ——A 組超凈臺內(nèi)快速密封后放入培養(yǎng)箱，B 組在普通環(huán)境下打開皿蓋 10 秒再密封，若 B 組長菌、A 組無菌→操作 / 環(huán)境空氣污染。
二、針對性解決方案（按污染來源分類）

（一）培養(yǎng)箱內(nèi)殘留污染（核心處理步驟）
徹底清潔消毒（分 3 步，避免殘留）：
第一步：物理清除。斷電冷卻后，用無菌棉簽蘸取 75% 酒精（或 0.5% 次氯酸鈉溶液）擦拭內(nèi)膽、擱板、門封條，重點清理霉斑和培養(yǎng)基殘留（擱板可取出用高壓滅菌鍋滅菌，或用 80℃烘干箱烘烤 2 小時）；
第二步：深度消毒。關(guān)閉箱門，開啟紫外線燈照射 60 分鐘（確保紫外線燈未過期，亮度≥70μW/cm²），或用 “過氧化氫熏蒸”（實驗室常用：30% 過氧化氫按 10-15mL/m³ 體積，加熱熏蒸，密閉 24 小時后通風）；
第三步：濕度系統(tǒng)消毒。排空加濕器水箱，用 5% 檸檬酸溶液浸泡水箱 + 管道 30 分鐘，清水沖洗 3 次后，注入無菌水（每周更換 1 次，避免水箱滋生霉菌）。
檢查并更換 HEPA 過濾器（關(guān)鍵！）：
若培養(yǎng)箱有進氣 HEPA 過濾器（過濾精度≥0.3μm），用塵埃粒子計數(shù)器檢測出風口，若粒子數(shù)超標（≥0.5μm 粒子＞3500 個 / L），或過濾器使用超過 1 年→直接更換（聯(lián)系廠家售后，避免自行拆卸導致密封失效）。
（二）空白載體 / 耗材污染處理
  • 一次性耗材：選擇正規(guī)廠家，檢查外包裝是否破損、滅菌日期是否在有效期內(nèi)；
  • 自制培養(yǎng)基：滅菌后若需存放，需在 4℃冰箱密封保存，且不超過 7 天；使用前在 60℃水浴鍋復溫，避免冷凝水導致皿內(nèi)污染；
  • 無菌水 / 緩沖液：現(xiàn)配現(xiàn)用，若存放需密封并標注日期，超過 3 天直接丟棄。
（三）操作 / 環(huán)境空氣污染防控
規(guī)范操作流程：
  • 放入 / 取出樣品時，培養(yǎng)箱門打開時間≤20 秒，避免正對箱內(nèi)呼氣；
  • 空白培養(yǎng)皿僅在超凈臺內(nèi)打開，開蓋后盡快密封（或倒入培養(yǎng)基后立即封口），手套每操作 1 小時更換 1 次，或用 75% 酒精擦拭消毒；
優(yōu)化實驗室環(huán)境：
  • 培養(yǎng)箱所在房間保持潔凈（定期拖地、紫外線消毒），避免與霉菌接種室、樣品處理室同屋（減少空氣雜菌濃度）；
  • 若房間灰塵較多，可在培養(yǎng)箱旁放置空氣凈化器（HEPA 級），降低空氣含菌量。
三、驗證效果：空白培養(yǎng)驗證試驗

處理后需做 “空白對照驗證”，確保污染已清除：
準備 3 組空白培養(yǎng)皿（每組 3 個）：
組 1：超凈臺內(nèi)密封，不放入培養(yǎng)箱（驗證耗材無菌性）；
組 2：超凈臺內(nèi)密封后放入培養(yǎng)箱，同常規(guī)培養(yǎng)條件（30-35℃，濕度 70-85%）培養(yǎng) 72 小時；
組 3：超凈臺內(nèi)開蓋 10 秒后密封，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)（驗證操作 + 環(huán)境污染）。
判定標準：3 組均無霉菌 / 雜菌生長→污染已解決；若組 2 / 組 3 仍長菌→需重新檢查培養(yǎng)箱消毒或 HEPA 過濾器。

四、長期預(yù)防措施（避免復發(fā)）

定期維護培養(yǎng)箱（制定SOP）：
  • 每周：更換加濕器無菌水，用75%酒精擦拭內(nèi)膽+門封條；
  • 每月：深度消毒1次（紫外線 + 酒精擦拭+霉菌專用殺菌劑），檢查 HEPA 過濾器壓差（壓差過高→堵塞，需更換）；
  • 每季度：聯(lián)系廠家校準溫度、濕度，檢查箱內(nèi)密封性能（門封條若老化、變形，及時更換）。
空白對照設(shè)置規(guī)范：
  • 每次實驗均設(shè)置 “耗材空白”（未接觸培養(yǎng)箱）和 “培養(yǎng)箱空白”（接觸培養(yǎng)箱），便于快速定位污染來源；
  • 空白培養(yǎng)皿與樣品皿分開擺放（避免樣品皿交叉污染空白），最好分層放置（空白在上，樣品在下）。
避免培養(yǎng)箱內(nèi)過度潮濕：
  • 培養(yǎng)過程中若皿內(nèi)有大量冷凝水，可適當降低濕度（或在培養(yǎng)箱內(nèi)放置干燥劑，定期更換），避免霉菌在冷凝水表面滋生；
  • 樣品皿若有培養(yǎng)基溢出，立即清理（用酒精擦拭污染區(qū)域，避免殘留霉變）。
五、常見誤區(qū)提醒
  • 僅用紫外線消毒不夠：紫外線無法穿透霉斑、培養(yǎng)基殘留，需先物理清除污染物，再結(jié)合酒精/過氧化氫消毒/臭氧/霉菌專用殺菌劑；
  • 加濕器加自來水：自來水含霉菌孢子、細菌，必須用無菌水或蒸餾水（每周更換，避免水箱成為 “污染源”）；
  • 忽視擱板污染：擱板縫隙易殘留培養(yǎng)基，需定期取出清洗滅菌（尤其是有樣品溢出后）。
若按上述方法處理后，空白仍長菌，可能是培養(yǎng)箱內(nèi)膽密封失效（如門封條破損、箱體漏氣）或加熱管 / 濕度傳感器污染，建議聯(lián)系廠家售后進行拆機深度清潔和維修。
編輯：songjiajie2010

 
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