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數(shù)字PCR（dPCR，Digital Polymerase Chain Reaction）是一種能夠?qū)怂岱肿舆M(jìn)行絕對定量的PCR技術(shù)。它不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照物，而是通過一種“分而治之”的策略來實(shí)現(xiàn)高精度的檢測。
以下是其詳細(xì)的工作原理，分為三個(gè)核心步驟：
1. 樣品分區(qū)
這是數(shù)字PCR最核心的環(huán)節(jié)。
目的：將一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系（包含待檢測的DNA模板、引物、熒光探針等）隨機(jī)分配到成千上萬個(gè)獨(dú)立、微小的反應(yīng)單元中。
方式：
（1）微滴式：通過微流控或油包水技術(shù)，將樣品生成數(shù)萬個(gè)甚至數(shù)百萬個(gè)納升級別的微滴（如Bio-Rad的QX系列）。
（2）芯片式：將樣品分配到物理分隔的微孔芯片中（如Thermo Fisher的QuantStudio系列）。
（3）物理分割：使用高密度的微流控芯片進(jìn)行物理隔離。
（4）關(guān)鍵結(jié)果：分區(qū)后，每個(gè)微反應(yīng)單元要么含有0個(gè)目標(biāo)分子，要么含有1個(gè)（或極少數(shù)情況多個(gè)）目標(biāo)分子。這個(gè)過程遵循泊松分布的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理。
2. PCR擴(kuò)增與終點(diǎn)檢測
分區(qū)完成后，這些反應(yīng)單元（微滴或微孔）會(huì)在常規(guī)的熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
擴(kuò)增：每個(gè)微反應(yīng)單元獨(dú)立進(jìn)行PCR反應(yīng)。如果某個(gè)單元內(nèi)包含至少一個(gè)目標(biāo)DNA分子，擴(kuò)增后該單元的熒光信號會(huì)顯著增強(qiáng)（陽性）；如果單元內(nèi)沒有目標(biāo)分子，則沒有熒光信號（陰性）。
檢測：擴(kuò)增結(jié)束后，儀器會(huì)逐個(gè)讀取每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號。這個(gè)過程就像數(shù)數(shù)一樣，記錄下哪些孔/微滴亮了（陽性，1），哪些沒亮（陰性，0）。
3. 絕對定量分析
這是將熒光信號轉(zhuǎn)化為精確數(shù)據(jù)的步驟。
計(jì)數(shù)：儀器統(tǒng)計(jì)陽性單元的數(shù)量（即發(fā)生了擴(kuò)增的單元）和陰性單元的數(shù)量（未發(fā)生擴(kuò)增的單元）。
泊松校正：理論上，我們希望在分區(qū)時(shí)每個(gè)單元最多只有一個(gè)分子。但由于隨機(jī)分布，有可能出現(xiàn)兩個(gè)或多個(gè)目標(biāo)分子進(jìn)入同一個(gè)單元的情況。例如，如果10000個(gè)單元中有400個(gè)是陽性，你不能簡單地認(rèn)為只有400個(gè)分子，因?yàn)槟?00個(gè)陽性單元中可能有些單元含有多個(gè)分子。因此，需要利用泊松分布公式進(jìn)行校正：通過陽性單元的比例（即陽性單元數(shù)/總有效單元數(shù)），計(jì)算出樣本中目標(biāo)DNA分子的絕對起始拷貝數(shù)或濃度。
結(jié)果輸出：直接輸出拷貝數(shù)/µL（微升）或copies/reaction（拷貝/反應(yīng)），無需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線。
與傳統(tǒng)qPCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）的對比：
以下是其詳細(xì)的工作原理，分為三個(gè)核心步驟：
1. 樣品分區(qū)
這是數(shù)字PCR最核心的環(huán)節(jié)。
目的：將一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系（包含待檢測的DNA模板、引物、熒光探針等）隨機(jī)分配到成千上萬個(gè)獨(dú)立、微小的反應(yīng)單元中。
方式：
（1）微滴式：通過微流控或油包水技術(shù)，將樣品生成數(shù)萬個(gè)甚至數(shù)百萬個(gè)納升級別的微滴（如Bio-Rad的QX系列）。
（2）芯片式：將樣品分配到物理分隔的微孔芯片中（如Thermo Fisher的QuantStudio系列）。
（3）物理分割：使用高密度的微流控芯片進(jìn)行物理隔離。
（4）關(guān)鍵結(jié)果：分區(qū)后，每個(gè)微反應(yīng)單元要么含有0個(gè)目標(biāo)分子，要么含有1個(gè)（或極少數(shù)情況多個(gè)）目標(biāo)分子。這個(gè)過程遵循泊松分布的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理。
2. PCR擴(kuò)增與終點(diǎn)檢測
分區(qū)完成后，這些反應(yīng)單元（微滴或微孔）會(huì)在常規(guī)的熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
擴(kuò)增：每個(gè)微反應(yīng)單元獨(dú)立進(jìn)行PCR反應(yīng)。如果某個(gè)單元內(nèi)包含至少一個(gè)目標(biāo)DNA分子，擴(kuò)增后該單元的熒光信號會(huì)顯著增強(qiáng)（陽性）；如果單元內(nèi)沒有目標(biāo)分子，則沒有熒光信號（陰性）。
檢測：擴(kuò)增結(jié)束后，儀器會(huì)逐個(gè)讀取每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號。這個(gè)過程就像數(shù)數(shù)一樣，記錄下哪些孔/微滴亮了（陽性，1），哪些沒亮（陰性，0）。
3. 絕對定量分析
這是將熒光信號轉(zhuǎn)化為精確數(shù)據(jù)的步驟。
計(jì)數(shù)：儀器統(tǒng)計(jì)陽性單元的數(shù)量（即發(fā)生了擴(kuò)增的單元）和陰性單元的數(shù)量（未發(fā)生擴(kuò)增的單元）。
泊松校正：理論上，我們希望在分區(qū)時(shí)每個(gè)單元最多只有一個(gè)分子。但由于隨機(jī)分布，有可能出現(xiàn)兩個(gè)或多個(gè)目標(biāo)分子進(jìn)入同一個(gè)單元的情況。例如，如果10000個(gè)單元中有400個(gè)是陽性，你不能簡單地認(rèn)為只有400個(gè)分子，因?yàn)槟?00個(gè)陽性單元中可能有些單元含有多個(gè)分子。因此，需要利用泊松分布公式進(jìn)行校正：通過陽性單元的比例（即陽性單元數(shù)/總有效單元數(shù)），計(jì)算出樣本中目標(biāo)DNA分子的絕對起始拷貝數(shù)或濃度。
結(jié)果輸出：直接輸出拷貝數(shù)/µL（微升）或copies/reaction（拷貝/反應(yīng)），無需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線。
與傳統(tǒng)qPCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）的對比：
| 特性 | 數(shù)字PCR （dPCR） | 實(shí)時(shí)熒光定量PCR （qPCR） |
| 原理 | 無限稀釋 + 終點(diǎn)計(jì)數(shù) | 擴(kuò)增曲線 + Ct值（循環(huán)閾值） |
| 定量方式 | 絕對定量（直接計(jì)數(shù)） | 相對定量（依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線） |
| 依賴標(biāo)準(zhǔn)品 | 不需要 | 必須依賴標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)參基因 |
| 靈敏度 | 極高（可檢測稀有突變，1/100000） | 較高 |
| 主要優(yōu)勢 | 不受擴(kuò)增效率影響，高精度，抗抑制能力強(qiáng) | 動(dòng)態(tài)范圍寬，成本較低，操作簡便 |
